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RNA酶實(shí)驗(yàn)避免污染問題注意事項(xiàng)
點(diǎn)擊次數(shù):191 更新時(shí)間:2024-12-31

RNase酶非常穩(wěn)定,是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些ji端的條件可以暫時(shí)失活,但限制因素去除后又迅速復(fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的RNase完wan全失活。為了獲得高質(zhì)量的真核細(xì)胞mRNA,必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細(xì)胞和滅活RNA酶同步進(jìn)行的方法,最大限度地降低細(xì)胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。同時(shí),避免偶然引入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶污染問題的一些注意事項(xiàng)。大多數(shù)有經(jīng)驗(yàn)的研究者并不拘泥于這些注意事項(xiàng),只是在遇到問題時(shí)可能采用其中的一種或幾種方法加以解決。我們謹(jǐn)將下述內(nèi)容作為解決RNA酶污染問題的實(shí)驗(yàn)指南。

1.塑料制品:盡可能使用無菌、一次性塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品,如沒有開封使用過,通常沒有必要再次處理。對于國產(chǎn)塑料制品,有些廠家提供的產(chǎn)品已達(dá)到RNase-free,可以直接使用,再次處理容易造成二次污染,得不償失。但原則上國產(chǎn)塑料制品處理后方可使用。處理方法如下:

(1)在玻璃燒杯中注入去離子水,加入焦碳酸2乙酯(DEPC)使DEPC的終濃度為0.1%。注意:DEPC有致癌之嫌,須在通風(fēng)柜中小心操作。

(2)將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

(3)在通風(fēng)柜中37℃或室溫下處理過夜。

(4)將EDPC水溶液小心倒入廢液瓶中,用鋁箔封住含DEPC水處理過的塑料制品的燒杯,高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。上述處理可以除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。

(5)用合適的溫度(80-90℃)烘烤至干燥,置于干凈處備用。

2.玻璃和金屬制品:實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃和金屬器皿經(jīng)常有RNA酶污染,使用前必須于180℃干烤8小時(shí)或250℃烘烤3小時(shí)以上。另一種方法是用0.1%的DEPC水溶液浸泡。

3.電泳槽:用于RNA電泳的電泳槽應(yīng)用去污劑洗干凈,再用水沖洗,用乙醇干燥,然后灌滿3%的H2O2溶液,于室溫放置10分鐘,然后用0.1%DEPC處理過的水徹di底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿,塑料制品和電泳槽作上特殊標(biāo)記,存放在指zhi定地點(diǎn),為RNA實(shí)驗(yàn)專用。

4.移液器:RNase的又一污染源是移液器。根據(jù)移液器制造商的要求對移液器進(jìn)行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的內(nèi)部和外部,基本達(dá)到要求。移液器金屬退頭器是RNA酶的一個(gè)重要來源,實(shí)驗(yàn)前最好取下它。

5.溶液:用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿??赡艿脑捜芤簯?yīng)用0.1%DEPC水于37℃至少處理12小時(shí),然后于100℃加熱15分鐘或在15 lbf/in2(1.034×105Pa)的高壓下蒸氣滅菌30分鐘。注:DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,可存幾瓶新的,未開封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。

6.研究人員:RNA酶廣泛存在于人的皮膚上,最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此,在準(zhǔn)備分離和分析RNA的材料和溶液時(shí),以及在涉及RNA的一切操作過程中,都應(yīng)戴一次性手套,接觸“臟的"玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)勤換手套。

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