實(shí)驗(yàn)方法原理
去除 5' 端的磷酸基可防止質(zhì)粒 DNA 的自身連接和環(huán)化。在體外連接反應(yīng)中，DNA 連接酶可在鄰近的兩個(gè)分子間形成磷酸二酯鍵。但只有當(dāng)一個(gè)分子的 5' 端帶有磷酸基另一分子的 3' 端帶有羥基時(shí)，這一反應(yīng)才能完成。

實(shí)驗(yàn)材料 小牛腸堿性磷酸酶（CIP) 或蝦堿性磷酸酶（SAP)蛋白酶 K限制性內(nèi)切核酸酶載體 DNA

試劑、試劑盒 EDTAEGTA乙醇酚氯仿 SDSTETris-Cl

儀器、耗材 瓊脂糖凝膠水浴

實(shí)驗(yàn)步驟

一、材料

1. 緩沖液和溶液

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)，EGTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)，乙醇，酚，酚：氯仿（1:1，V/V)， SDS (10%，m/V)，乙酸鈉（3 mol/L pH 5.2 和 pH 7.0)，TE ( pH 8.0)，Tris-Cl ( 10 mmol/L，pH 8.3)。

2. 酶與緩沖液

小牛腸堿性磷酸酶（CIP) 或蝦堿性磷酸酶（SAP)，蛋白酶 K ( 10 mg/ml)，限制性內(nèi)切核酸酶。

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠（0.7%)，用含有 0.5 μg/ml 溴化乙錠的 TBE 制備。

4. 核酸和寡核苷酸

載體 DNA ( 閉環(huán)質(zhì)粒）。

5. 專用設(shè)備

可調(diào)至 56℃ 或 65℃ 的水浴。

二、操作方法

1. 用 2~3 倍過(guò)量的限制酶消化一份合理量（10 μg) 的閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 1 h。

2. 取出一小份（0.1 μg) DNA，用含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠（0.7%) 電泳檢査消化程度，用未被消化的質(zhì)粒 DNA 作對(duì)照。如消化不*，應(yīng)添加更多的酶繼續(xù)消化。

3. 如已消化*，用酚：氯仿抽提一次，再用乙醇沉淀回收 DNA。將乙醇溶液置于冰上 15 min。

4. 于 4℃ 用最大轉(zhuǎn)速離心回收 DNA，用 110 μl 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.3) 溶解 DNA。保留 20 μl 的 DNA 以備以后用作對(duì)照。

5. 向余下的 90 μl 線狀 DNA 中加入 10 μl 10X CIP 或 10X SAP 緩沖液和適量的小牛腸堿性磷酸酶（CIP) 或蝦堿性磷酸酶（SAP) 并按表 1-8 中的方法進(jìn)行溫育。

6. 滅活磷酸酶：

滅活 CIP：在達(dá)到溫育時(shí)間后，加入 SDS 和 EDTA ( pH 8.0) 使終濃度分別為 5% 和 5 mmol/L，充分混勻，再加入蛋白酶 K 使終濃度為 100 μg/ml，于 55℃ 溫育 30 min。也可在 5 mmol/L EDTA 10 mmol/L EGTA ( pH 8.0 ) 存在的條件下于 65℃ 溫育 30 min 使 CIP 失活（或 75℃ 10 min)。或失活 SAP：在去磷酸化緩沖液中使反應(yīng)混合物于 65℃ 溫育 15 min。去磷酸化反應(yīng)結(jié)束后，在進(jìn)行連接反應(yīng)前去除或使堿性磷酸酶*失活是很重要的。盡管 CIP 或 SAP 都可通過(guò)上述方法失活，但我們?nèi)越ㄗh在使用去磷酸化的 DNA 進(jìn)行連接之前最好用酚：氯仿抽提一下去磷酸化反應(yīng)的混合物。

7. 使反應(yīng)混合物冷至室溫，而后用酚抽提一次，再用酚：氯仿抽提一次。

8. 用乙醇沉淀法回收 DNA。再次混勻溶液，置于冰上 15 min。

9. 于 4℃ 用最大轉(zhuǎn)速離心回收 DNA，用 70% 乙醇洗滌 DNA 沉淀，于 4℃ 再次離心。

10. 小心棄去上清液，將開(kāi)蓋的離心管置于工作臺(tái)直至乙醇蒸發(fā)殆盡。

11. 用 TE ( pH 8.0) 溶解沉淀的 DNA 使?jié)舛葹?100 μg/ml。以小份分裝 DNA 于 -20℃ 保存。