細(xì)胞的凍存:為避免污染造成的損失，最小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對(duì)于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：
◆包含10％甘油的wan全培養(yǎng)基，
◆包含10％二甲基亞砜（DMSO）的wan全培養(yǎng)基，
◆50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基，或
◆50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對(duì)于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
◆50％ 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或
◆包含有7.5％二甲基亞砜和10％細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。
1.懸浮細(xì)胞
●計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
2.貼壁細(xì)胞
●使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時(shí)盡可能溫和，使對(duì)細(xì)胞的損傷減少到最小。
●在wan全生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)。
●以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
